中文国产成人精品久久综合,日韩卡二卡三卡四卡永久入口,精品国产女同疯狂摩擦,中字幕一区二区三区乱码

Fc受體與流式染色

FcR(Fc受體)是一類能夠和抗體Fc片段特異結合的細胞表面蛋白，不同類型的細胞可以表達不同類型的FcR，對應和不同結構類型的抗體相結合，而流式染色用的大多是IgG類型的單克隆抗體，其結合的Fc受體為FcγR，根據與抗體Fc片段親和力的強弱可將FcγR分為三個亞家族：FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）和FcγRIII（CD16）。

FcγRI主要表達在單核細胞、巨噬細胞和DC細胞以及活化的中性粒細胞和嗜酸性粒細胞。FcγRII有三種形式，FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc，FcγRIIa主要在中性粒細胞、單核細胞、DC細胞表面表達；FcγRIIb主要在髓系細胞和B細胞表面；FcγRIIc 主要在單核巨噬細胞、中性粒細胞和NK細胞表面表達。FcγRIII 在體內有FcγRIIIa和FcγRIIIb兩種亞型，和IgG的結合力分別為中度和低親和力，FcγRIIIa幾乎在所有白細胞中表達；而FcγRIIIb主要在中性粒細胞中表達。

在流式染色過程中，如果我們需要染色的細胞高表達Fc受體，那么在抗體染色的過程中，抗體的Fc段會與細胞表面的Fc受體進行結合，從而產生非特異性的染色背景，最終導致流式實驗結果出現假陽性。那么在流式染色過程中如何避免這類結果的出現呢？

圖1：左邊圖只有抗體與Fc受體結合產生的信號，屬于假陽性；右邊圖抗體與抗原和Fc受體都有結合，染色陽性。

方法一：可通過Fc受體阻斷劑（Fc受體抗體），在流式染色抗體加入之前，先加入Fc受體抗體孵育細胞，將細胞的Fc受體占據，這樣后續加入的流式染色抗體就就很難與Fc受體結合了。當然，并非所有的流式染色都要加入Fc受體阻斷劑，一般我們只針對表達Fc受體的細胞并且染色出現異常考慮使用。此外，對于人類細胞的染色，Fc受體的阻斷并不是特別重要，因為流式抗體（動物來源的單克隆抗體）與人細胞的Fc受體結合效率很低，如果特定情況下出現染色背景，可以考慮使用染色抗體來源物種的血清孵育細胞，或者用人AB 型血清對細胞進行孵育，這樣會明顯地阻斷單克隆抗體的非特異性結合。

圖2：上圖通過加入Fc受體阻斷劑，可抑制染色抗體與Fc受體的結合

方法二：可通過用同型對照，此時需要留一管細胞加入同型對照抗體（與流式染色抗體相同種屬來源，相同亞型，相同標記，相同使用量），我們流式染色管的結果只需以同型對照染色管的結果為陰性參照。加入的同型對照抗體會和細胞表面的Fc受體結合，如果加入的流式染色抗體能產生大于同型對照染色的信號，則說明流式染色結果是陽性的。

圖3：左圖為Fc受體染色背景，中圖流式抗體染色結果為陰性，右圖流式抗體染色結果為陽性。

除了考慮Fc受體的影響外，在活細胞的表面染色中，單核細胞和巨噬細胞均存在吞噬抗體或熒光素發生非特異性結合的現象，這個時候尤其需要做好相應的對照來排除假陽性染色。

細胞因子是由免疫細胞（淋巴細胞、單核-巨噬細胞等）和相關細胞（成纖維細胞、內皮細胞等）產生的調節細胞功能的高活性多功能多肽或蛋白質分子，通過結合細胞表面的相應受體發揮生物學作用。不同哺乳動物在進化過程中其分泌的細胞因子氨基酸序列存在差異，這就告訴我們在進行實驗時需要選擇對應種屬的細胞因子，然而世界上的物種豐富多彩，從無脊柱動物到脊椎動物都可能有細胞因子的表達，而且各種動物都可能成為生物學家的研究對象，有時需要特定動物，如牛、狗、貓、魚等的細胞因子來做實驗，但是商品化的細胞因子多數是重組人、大鼠或小鼠的，針對特殊物種的重組細胞因子很難買到。那么如何確定重組人、大鼠或小鼠的細胞因子是否能用于培養特殊動物來源的細胞呢？這就需要我們來判斷種屬之間的交叉反應！我們推薦通過以下途徑來獲得信息。


在PeproTech的官方網站進行查詢，具體方法為：

1.在瀏覽器的地址欄輸入：www.peprotech.com；

2.根據產品名稱(如Recombinant Human VEGF165 )或產品編號(Cat#100-20)找到您需要了解的細胞因子；

3.點擊該細胞因子的鏈接，向下翻動頁面，找到“Cross Reactivity Cited in References (引自文獻的交叉反應)”欄；

4.在“Cross Reactivity Cited in References (引自文獻的交叉反應)”欄，可看到Recombinant Human VEGF165(Cat#100-20)已應用的種屬，如雞(Chicken)、牛(Cow)、豚鼠(Guinea Pig)、馬(Horse)、人(Human) 、豬(Pig) 、兔(Rabbit)、大鼠 (Rat) 羊(Sheep)、鱒魚(Trout) 和斑馬魚(Zebra Fish)等(見下圖1)。

5.點擊相應種屬鏈接如鱒魚(Trout)(如上圖一紅色箭頭所示)，即可查得對應參考文獻(見下圖二)。

如果您感興趣的種屬暫時沒有對應的參考文獻，您也可以使用PubMad的BLAST工具，將已知種屬細胞因子的氨基酸序列與PubMad數據庫中您感興趣的種屬蛋白序列進行同源比對。一般來說，不同種屬之間蛋白同源性（序列一致性）高于80%以上的基本上就可確定為有交叉活性，可推薦使用。我們以比對Recombinant Human EPO(Cat#100-64)與PubMad數據庫中牛的EPO同源性比對為例，進行示范。

1.首先打開PubMad主頁(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)，向下翻動頁面，找到BLAST入口(如下圖三)。

2.在Web BLAST欄選擇Protein BLAST(如下圖四)。

3.在PeproTech官網輸入100-64，點擊該產品鏈接，找到Recombinant Human EPO的氨基酸序列(如下圖五)。

4.將該氨基酸序列，復制粘貼至氨基酸序列框(如下圖六)。

4點擊BLAST按鍵進行比對(如下圖七)。

5比對過程較慢可稍等片刻。此時比對的是數據庫中的所有種屬，可在篩選欄限定您感興趣的種屬進行查詢。如在Organism欄輸入Bos Taurus(牛的拉丁文名稱)，點擊Filter鍵進行篩選(如下圖八)，即可迅速找到與牛EPO比對的Per Ident值為83.23％(如下圖九)。說明已知的Recombinant Human EPO可以嘗試應用于牛細胞培養。

注：篩選時一般需使用物種的拉丁文名進行限定，可根據下表一進行查詢。

表一：物種中文與拉丁文對照表

PeproTech的所有細胞因子和蛋白均為凍干粉，這使得運輸非常便捷，常溫條件即可。而且，細胞因子和蛋白凍干粉非常穩定，在-20℃或-80℃條件下可保存數年。凍干粉在使用前需進行溶解，然后以液體形式加到培養體系或注射入動物體內。溶解步驟非常關鍵，溶解不好會導致細胞因子或蛋白的失活，這也是很多用戶在實際使用中經常遇到的問題。

那么，應該如何進行正確的溶解呢？

下面我們以Recombinant Human IL-4 (重組人IL-4，產品編號：200-04)的說明書為例，對細胞因子或蛋白的溶解方法進行詳細的闡述。
拿到重組人IL-4的說明書后，您會發現有一段關于Reconstitution(重懸)的敘述，這段內容含有溶解相關的所有信息。

1. Centrifuge the vial prior to opening
第 1 步：開蓋前離心試劑管
PeproTech的細胞因子或蛋白凍干粉裝盛在塑料管中，為無菌包裝。凍干粉在運輸過程中可能會因顛簸而飄散并粘貼于管壁或管蓋上，所以在打開塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉完全溶解。
有很多用戶會問一個問題，即應該用多少轉速、多長時間離心試劑管，才能達到良好的收集效果？
答：有些小型高速離心機(多為進口品牌)的面板上有一個Spin鍵，按了此鍵后，離心機會自動快速上升到其最大速度(10000rpm或12000rpm)，上升到最高點后速度即刻下降，直至停止旋轉，整個過程大約30s。這個Spin鍵足以很好的將細胞因子或蛋白收集到管底。但有些實驗室沒有這樣的高速離心機，只有最高轉速為4000-4500rpm的離心機。這種情況下，需3000-3500rpm離心5min，也能達到類似的效果。

2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do not vortex.
第 2 步：用無菌水重懸至 0.1-1.0 mg/ml ，不可振蕩。
這個步驟即為溶解步驟，非常重要。

1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉
用于溶解細胞因子或蛋白的溶液千差萬別。此例中的重組人IL-4需用水溶解，而重組人IL-2 (產品編號：200-02)則需用100mM Acetic Acid (醋酸)溶解，重組人TGF-beta1 (產品編號：100-21)需用10mMCitric Acid (檸檬酸)，pH3.0溶解，重組人FGF-basic(產品編號：100-18B)需用5mMTris，pH7.6溶解，重組人FGF-10(產品編號：100-26)需用5mMSodium Phosphate(磷酸鈉)，pH7.4溶解，重組IL-13(產品編號：200-13)需用20mMMHCl溶解。(注：即使同一重組細胞因子或蛋白，不同批次的溶解方法也可能有所不同，因此上面的敘述僅供參考。具體應該如何溶解應以相應批次的官方說明書為準)。后續的文章中將對各種溶解液的配制方法進行詳細的闡述，望繼續關注。

經常有用戶會問，為什么會有這么多種溶解方法？
答：我們知道，蛋白的溶解性與很多因素有關，其中比較重要的是pH值和離子強度。PeproTech的細胞因子或重組蛋白在出廠前均經嚴格測試，說明上所標明的溶解液是能夠將該細胞因子或重組蛋白完全溶解的液體。如果您所用的溶解液的pH值和離子強度與說明書中所標明的不符，很多時候會造成細胞因子或重組蛋白不能完全溶解或者根本無法溶解，這樣所配得的細胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。

有不少用戶沒注意說明書上的描述，而是根據習慣，直接用PBS或培養液(1640或DMEM等)等溶解細胞因子或蛋白的凍干粉。這樣做可以嗎？
答：有時可以，要看具體情況。PeproTech的大多數細胞因子或蛋白凍干粉的溶解液不是PBS，此時千萬不能用PBS或培養液直接來溶解，具體原因在上面已經敘述過。而有部分細胞因子，如重組人KGF(產品編號：100-19)和重組人FGF-23(產品編號：100-52)等，說明書上的溶解液即為1x PBS，此時用PBS溶解完全沒問題，那么用培養液溶解也是可以的，不過最好還是用先用PBS溶解，然后再用培養液稀釋。

2) 一定要溶解到指定的濃度。

蛋白在一定的濃度范圍內可以保持良好的穩定性，這個范圍就是說明書上所標明的濃度范圍，該例為0.1-1.0 mg/ml。這個濃度范圍對于不同的細胞因子或重組蛋白是不同的。如重組人FGF-6(產品編號：100-30)為0.5-1.0mg/ml，而重組人Activin B(產品編號：120-15)則一定要是0.5mg/ml。

高于或低于該濃度范圍會有什么問題呢？

答：首先，細胞因子或蛋白會不穩定，即很容易出現活性下降的現象。其次，高于這個濃度范圍，可能會超過該蛋白的最大溶解濃度，即蛋白無法完全溶解。再者，高于或低于該濃度范圍，蛋白可能會出現聚集(aggregation)，最終結果還是部分蛋白未溶解，導致蛋白活性的減弱。

3) 一定不能振蕩(vortex)。
這里所說的振蕩是指用渦旋儀進行快速振蕩。

有用戶會問，若想保證溶解液與凍干粉充分混勻，以實現細胞因子或重組蛋白的完全溶解，該怎么辦呢？
答：多數細胞因子或重組蛋白的凍干粉是非常容易溶解的，一般我們用移液槍的槍頭輕吹幾下，即可使細胞因子或重組蛋白完全溶解。

對于不易溶解的細胞因子或蛋白，PeproTech會在說明書中進行備注(Note)。如在重組人IL-13(產品編號：200-13)的說明書中您會看到：Slow to dissolve (緩慢溶解)，在重組人IL-11(產品編號：200-11)的說明中會看到： This solution is slow to dissolve.(該溶液溶解緩慢)。這種情況下，您最好能將要溶解的細胞因子或重組蛋白放在水平搖床(shaker)上低速搖一段時間，促使細胞因子或重組蛋白完全溶解。有些蛋白，如重組人IL-13 Variant (產品編號：200-13A)雖然難溶，但卻不需用搖床來加速溶解。其說明書上的備注為：Allow the reconstituted vial to sit at 4oC for at > 2 hours before use. (將重懸液在4oC靜置2小時以上)

3. This solution can be stored at 2-8℃ for up to 1 week.
第 3 步：該重懸液在 2-8℃ 最長可保存 1 周。
用說明書上推薦的溶液將細胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度后，細胞因子或重組蛋白可放置在2-8℃，即冰箱的冷藏室。在這種條件下，細胞因子或重組蛋白的活性最長可保持1周。這對一個周期為5-7天的實驗，如DC(樹突狀細胞)的誘導成熟是足夠的。在此期間，只要每次從冰箱里吸取一定量的細胞因子或重組蛋白溶液加入到培養體系內即可。
其實，說明書上推薦的濃度對于一般的實驗來講是比較高的。所以用戶通常會將該溶液進一步稀釋后再放在4℃保存，待1周內用完。如進行稀釋，必須遵照下面第4步的方法，即需用含載體蛋白的溶液進行稀釋，否則稀釋后的細胞因子或重組蛋白很容易會粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細胞因子或重組蛋白的濃度下降，細胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。

4. For extended storage, it is recommended to further dilute in a buffer containing a carrier protein (example 0.1% BSA) and store in working aliquots at -20℃ to -80℃.
第 4 步：如要長期保存，則需用含載體蛋白 ( 如 0.1% BSA ，或 10% FBS ，或 5% HSA) 的溶液進一步稀釋，然后分裝凍存于 -20℃ 至 -80℃。
如果一個實驗周期長于一周，或配制的細胞因子或重組蛋白一次用不完，我們就需對細胞因子或重組蛋白進行長期保存。方法是：將已重懸的細胞因子或蛋白用含載體蛋白，如0.1% BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS(胎牛血清)，5% HSA(人血清白蛋白)的溶液將重懸液進一步稀釋，然后分裝凍存于-20℃至-80℃，即常規冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。

經常有人會在細胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后直接分裝凍存于-20℃至-80℃，這樣可以嗎？
答：不行。我們知道，塑料管壁對多數蛋白均有很好的吸附作用，也就是說溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后，蛋白是很難與管壁分離的。做過ELISA實驗的人都知道，ELISA的包被抗體(Capture antibody)就是通過這種粘附作用包被到酶標板上的。
載體蛋白，如1% BSA，10% FBS (胎牛血清)和5% HSA等的主要作用是預先封閉塑料管壁上的蛋白結合位點，使細胞因子或重組蛋白不會粘附于管壁。如果在細胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后不用含載體蛋白的溶液進一步稀釋，而直接分裝凍存，則溶液中的大部分細胞因子或重組蛋白均會粘附到管壁上，導致溶液中實際溶解的細胞因子或重組蛋白的濃度大為降低，最終表現為細胞因子或重組蛋白活性的下降。 因此，在分裝凍存前，一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進一步稀釋。 稀釋后的細胞因子或重組蛋白可為任意濃度，因大量的載體蛋白可以保證低濃度細胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩定性。

那么，含載體蛋白的溶液指的是什么溶液呢？水可以嗎？
答：水不可。該溶液通常是指pH近中性，有一定緩沖能力的緩沖液，如PBS，培養液(RPMI1640, DMEM等)等。

還有一個經常被問及的問題，即在做無血清培養或動物的體內實驗時，細胞因子中不能含有BSA，FBS或HSA等動物或人的蛋白，要想長期保存細胞因子或重組蛋白該怎么辦呢？
答：一種方法是訂購PeproTech的小包裝(size A)細胞因子或重組蛋白，每次使用一只，用后即廢棄。如覺得該方法過于浪費，則可用海藻糖(Trehalose)作為載體，用含海藻糖的溶液來稀釋已重懸的細胞因子或重組蛋白，然后分裝凍存。

總之，為保證細胞因子或重組蛋白凍干份在重懸后仍能保持良好的生物活性，必須按照說明書中 Reconstitution 的方法嚴格操作。

Q1：收到產品后如何處理?
A1：產品在運輸過程中由于顛簸，導致部分產品會粘附在管壁或蓋子上。我們推薦根據購買的小分子規格進行如下選擇：
1）如果規格小于10mg，建議一次性溶解，由于小分子的容器為玻璃瓶，對其進行離心很不方便，因此我們應該關閉超凈臺風機，打開蓋子，根據說明書推薦的溶解濃度加入對應體積的溶劑，用移液管反復吹打管底和管壁，蓋上蓋子后再顛倒混勻溶解可能殘存在蓋子上的粉末；
2）如果規格大于10mg，在有精密天平的條件下，可以稱取一定質量的粉末（可用EP管先調零天平，再加入粉末，最后稱取質量），根據稱取的質量加入相應體積的溶劑進行溶解。

Q2：化合物用什么溶解？
A2： 溶劑的選擇請參照產品說明書。很多小分子試劑不能直接溶解于水、PBS緩沖液或者生理鹽水，可以先用DMSO或乙醇配制儲存母液。儲存母液通常能夠長期保存，并且可以用水性溶劑稀釋到體內外實驗所需的濃度。通常，小分子產品在這些有機溶劑中的溶解度足夠高，可以使用水性溶劑按1:500到1:1000稀釋到其工作濃度。一般認為，少量的有機溶劑（例如0.1% DMSO）不會影響生物實驗，但是最好建立一個溶劑對照組，以排除溶劑的非特異性影響。

Q3：說明書注明化合物在特定濃度可以溶解，但化合物還是沒有完全溶解，怎么辦?
A3：有時需要使用一些輔助溶解的方法，如水浴加熱45℃以下，20-30min左右；或者用超聲波震蕩，15min左右，通常這樣處理后化合物都能夠完全溶解。如果這樣還不能完全溶解，請聯系我們技術支持獲取更多的幫助。

Q4：如何對工作液進行滅菌?
A4：由于市售的大部分小分子都沒有做無菌工藝處理，因此在使用小分子時需要考慮除菌，對于使用DMSO溶解的，因為DMSO本身有很強的殺菌能力，可認為配制好的溶液即為無菌溶液，對于用其它溶劑溶解的小分子可用0.22μm濾膜（有機溶劑專用濾膜）進行過濾除菌。請勿使用紫外、射線或者高壓蒸汽滅菌方式，否則可能破壞小分子試劑的化合物結構，影響其活性。

Q5：產品的儲存條件是什么？
A5：我們產品說明書上會明確表明該產品的具體儲存條件和注意事項，請按照說明書進行保存。建議參照說明書和實驗需求，選取合適的溶劑配制母液（DMSO，水，乙醇等）。通常，母液至少是工作液濃度的1000倍以上，分裝后放-20℃或者-80℃保存，避免反復凍融。大部分小分子的母液在-20°C下能保存3-12個月，5次以內的反復凍融不會明顯影響產品的生物活性。此外，有部分產品溶液不穩定，需要現用現配。對于這些產品，您需要在使用前配制溶液，并在24小時內用完。

Q6：凍存試劑可以室溫或37℃水浴解凍嗎？
A6：凍存試劑的解凍，建議在冰水浴或者冰浴條件下緩慢解凍。如果時間比較著急，大部分凍存的試劑可以在室溫或者37℃水浴解凍，但是需要小心觀察，邊晃動邊溶解，等到試劑部分溶解后，即需從水浴中取出，確保溶解過程中試劑還是接近0℃的。解凍后的試劑可以置于冰水浴或者冰浴中。

Q7：產品未經過滅菌處理能否用于細胞實驗?
A7：產品不是無菌狀態的，不能保證產品不會污染您的細胞，但是以下幾條防范措施可以有效避免細胞污染：
1）培養基必須含有青霉素、鏈霉素等抗生素，它們能夠有效避免絕大多數細菌污染；
2）使用純DMSO或者乙醇溶解小分子產品，它們有一定的滅菌能力；3）整個實驗過程在無菌條件下完成。

Q8：細胞實驗劑量及處理時間如何選擇？
A8：建議根據實驗室前期的實驗結果，同時結合相關的參考文獻確定合適的濃度和作用時間；除參考文獻外，還需要通過濃度梯度預實驗做“劑量-效應”曲線確定最佳作用濃度；通過時間梯度預實驗做“時間-效應”曲線確定最佳作用時間。如果沒有前期實驗結果，也沒有相關文獻報道，則建議您選擇相關的細胞株或者是相關實驗目的的其他文獻，選擇較寬的濃度范圍做濃度梯度預實驗。同時，小分子試劑的使用量受多種因素影響，比如作用細胞的通透性，可接觸性，孵育時間，細胞種類，傳代次數等。另外，需要設立溶解小分子試劑時所采用的溶劑作為對照，以排除溶劑的非特異性影響。

Q9：在動物實驗中如何使用小分子產品？（如給藥途徑、劑量、溶劑以及給藥周期等）
A9：建議用雙蒸水或PBS緩沖液稀釋到實驗所需的濃度。若是用DMSO配制的儲備母液，為減少對動物的毒性，建議 DMSO 的終濃度不要大于2% 。有些產品在水中的溶解度較低，導致DMSO母液在稀釋時析出的，可以通過添加助溶劑來幫助溶解，比如吐溫-80、Solutol、甘油、卵磷脂和聚乙二醇等。在動物給藥實驗中，要綜合考慮小分子試劑在體內的實際分布與給藥方式（口服、腹腔注射、靜脈注射，肌肉注射，皮下注射等）、藥物利用率，半衰期，清除率，受體結合量，分布容積等等緊密相關。特定組織或器官吸收試劑的量也往往比分離的細胞吸收量少。

Q10：如果所做動物實驗完全沒有文獻參考劑量怎么辦？
A10：如果沒有直接的文獻支持，建議查找與自己實驗體系接近的文獻，比如該小分子試劑在其他動物模型上的劑量、在其他實驗目的的劑量等，還可以根據不同實驗動物的體表面積進行等效劑量的轉換。通過綜合考慮得到一個初步的劑量，然后做小規模的預實驗進行劑量的優化。動物實驗還要考慮給藥方式，給藥間隔，給藥范圍，給藥體積，以及該小分子試劑的耐受劑量范圍，配制藥液的穩定性，該小分子試劑的溶劑是否需要等滲等問題。