引言：
人肝臟類器官以hESCs/iPSCs 為來源，將其誘導到定型內胚層，再誘導肝譜系特化的階段（HS），將細胞植入細胞外基質膠中，并且添加類器官培養(yǎng)成分Advanced DMEM/F12 、N2 、B27 、N-Acety-L-Cysteine、Gastrin、Nicotinamide、Glutamax、EGF、R-spondin1、A83-01 和Forskolin，進行3D培養(yǎng)獲得肝臟干細胞類器官（hEHOs）。
一、 實驗材料
1. 人胚胎干細胞系H9；
2. Matrigel人胚胎干細胞培養(yǎng)用基質膠(Corning, Cat#354277)，于冰上分裝后保存于-80℃；
3. Advanced DMEM/F12培養(yǎng)基（Thermo, Cat#12634010）；
4. HM 培養(yǎng)基（ScienCell，Cat#SC-5201）；
5. Matrigel類器官培養(yǎng)用基質膠(Corning, Cat#356231)，于冰上分裝后保存于-80℃；
6. Knock Out Serum Replacement(Thermo, Cat#A3181502), 分裝后保存于-20℃；
7. B-27? Supplement (50X) (Thermo, Cat#17504044), 分裝后保存于-20℃；
8. N-2 Supplement (100X) (Thermo, Cat#17502001), 分裝后保存于-20℃；
9. mTeSR?1 (Stemcell Technologies, Cat#85850)；
10. Activin A(PeproTech, Cat#120-14)配制為100μg/ml, 保存于-80℃，使用終濃度為100ng/ml；
11. R-spondin-1（PeproTech， Cat#120-38）配制為250μg/ml， 保存于-80℃，使用終濃度為250ng/ml；
12. Wnt-3a（PeproTech， Cat#315-20）配制為50μg/ml， 保存于-80℃，使用終濃度為50ng/ml；
13. BMP-4（PeproTech， Cat#120-05）配制為20μg/ml， 保存于-80℃，使用終濃度為20ng/ml；
14. FGF-2（PeproTech， Cat#100-18b）配制為10μg/ml， 保存于-80℃，使用終濃度為10ng/ml；
15. EGF（PeproTech， Cat#AF-100-15）配制為50μg/ml， 保存于-80℃，使用終濃度為50ng/ml；
16. Y-27632 (BioGems, Cat# 1293823)配制為10mM, 保存于-80℃，使用終濃度為10μM；
17. Forskolin (BioGems, Cat# 6652995)配制為10mM, 保存于-80℃，使用終濃度為10μM；
18. N-Acetyl-L-cysteine (BioGems, Cat# 6169116)配制為1.25M, 保存于-80℃，使用終濃度為1.25mM；
19. A83-01 (BioGems, Cat# 9094360)配制為5mM, 保存于-80℃，使用終濃度為5μM；
20. Gastrin I (BioGems, Cat# 1003377)配制為10μM, 保存于-80℃，使用終濃度為10nM；
21. Nicotinamide (BioGems, Cat#9899208)配制為10M, 保存于-80℃，使用終濃度10mM；
22. Accutase消化液(Thermo, Cat#A1110501)。
二、 ESCs/iPSC培養(yǎng)傳代步驟
1. hESCs的復蘇：預先將Matrigel（Cat#354277）從-80℃取出，置于冰上融化，隨后用預冷的DMEM/F1培養(yǎng)基稀釋100倍，取1ml加入六孔板一個孔，晃勻至鋪滿孔板底部。六孔板置于37℃培養(yǎng)箱中至少30min，備用。mTesR1人胚胎干細胞培養(yǎng)基提前從4℃冰箱取出，室溫放置約10min。從液氮凍存盒中取出H9細胞(hESC細胞系)，快速移入37℃水浴鍋中融化，輕柔晃動至凍存管還剩小塊冰即取出，小心將細胞轉入15ml離心管，加入５ml mTesR1培養(yǎng)基輕輕混勻細胞，1000rmp/5min離心，小心棄去上清，加入含10μM的Y-27632的mTesR1培養(yǎng)基重懸細胞，細胞接種于基質膠包被的培養(yǎng)板，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日加入DMEM/F12培養(yǎng)基輕柔洗一次，更換新鮮不含Y-27632的mTesR1培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
2. hESCs的培養(yǎng)：每天更換新鮮mTesR1培養(yǎng)基前應觀察細胞狀態(tài)，若發(fā)現大量死細胞漂浮于培養(yǎng)基（剛復蘇的細胞狀態(tài)較差），則棄去培養(yǎng)基，加入預熱的DMEM/F12培養(yǎng)基輕柔洗細胞一次，棄去DMEM/F12培養(yǎng)基，加入新鮮mTesR1培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
3. hESCs的傳代：細胞約3~5天生長至80%匯合度，狀態(tài)良好的hESCs克隆明顯，邊緣光滑。細胞傳代時根據實驗需要提前用Matrigel包被培養(yǎng)板，傳代比例為1：5~1：10，細胞用DMEM/F12培養(yǎng)基洗2次，在六孔板每孔中加入1ml Accutase消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化3~5min。每隔2min在倒置顯微鏡下觀察細胞，待克隆邊緣發(fā)亮即小心棄去消化液，加入2ml含含10μM的Y-27632的mTesR1培養(yǎng)基輕柔吹打細胞數次，收集細胞于15ml離心管，1000rmp/5min離心，小心棄去上清，加入含10uM的Y-27632的mTesR1培養(yǎng)基重懸細胞，轉入基質膠包被的培養(yǎng)板，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。過夜后更換新鮮的不含Y-27632的mTesR1培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液。
4. hESCs的凍存：凍存液為含5~10％二甲基亞砜（DMSO）的血清替代品(KOSR)，置于４°Ｃ備用。按照前述細胞傳代的方法收集細胞，用細胞凍存液輕柔重懸細胞，轉入凍存管，做好標記，置于凍存盒，-80℃過夜后轉入液氮中長期保存。
三、H9 細胞系向肝干/祖細胞誘導分化
1. 待H9 細胞在孔內融合度達到70-80%左右，細胞可進行誘導。按上述hESCs的傳代步驟操作，用Accutase消化液把細胞消化成單個細胞，按1×105 密度進行接種，加入含10μM Y-27632 的TeSR-E8 培養(yǎng)基。
2. 待24h細胞貼附后，將細胞培養(yǎng)基更換為RPMI1640，添加1X B27，100ng/mL Activin A，50ng/mL Wnt3a，使細胞向定性內胚層階段進行誘導分化。
3. 隔日棄去廢液，將細胞培養(yǎng)基更換為RPMI1640，添加1X B27，100ng/mL Activin A 作用一天。
4. 隔日棄去廢液，將細胞培養(yǎng)基更換為RPMI1640，添加1X B27，100ng/mL Activin A 再作用一天。定性內胚層階段誘導結束，向肝干/祖細胞階段進行誘導。
5. 隔日棄去廢液，將細胞培養(yǎng)基更換為Hepatocyte medium（HM），添加10ng/mL FGF-2，20ng/mL BMP-4，共作用5 天，每隔2 天換一次液體，肝干/祖階段細胞誘導結束。
四、肝臟類器官的擴增培養(yǎng)
1. 肝干/祖階段作用結束后，用1×PBS 洗兩遍，然后用0.25%Trypsin-EDTA 消化成單個細胞，用含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化, 室溫1000rpm，離心5min。
2. 將離心好的細胞棄盡上清后用Matrigel 進行重懸，每孔按3,000-10,000 密度接種，以每孔50μL 的液滴接種于24 孔板中，置于37℃培養(yǎng)箱孵育10min。
3. 待膠凝固后，往孔內添加500μl 擴增培養(yǎng)基。肝臟類器官擴增及傳代培養(yǎng)基配制：Advanced DMEM/F12+1X N2+1XB27++R-spondin1(250ng/mL)+ EGF(50ng/mL)+1%Glutamax+N-Acetyl-L-cysteine(1.25mM)
+Gastrin(10nM)+ Nicotinamide(10mM) +A83-01(5μM)+Forskolin(10μM) 。
4. 每隔兩天更換一次培養(yǎng)基，吸取培養(yǎng)基時用移液槍輕輕地沿孔壁一側吸取培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基時緩慢沿孔壁一側加入，不要把膠吹散。
五、肝臟類器官的傳代
1. 待細胞培養(yǎng)10天左右可進行傳代培養(yǎng)，按1：6~1：8比例進行傳代，先在原孔內機械法把細胞吹成小塊，然后把細胞轉移至15mL 離心管。
2. 室溫300g，離心5min，棄去上清，添加Accutase，置于37℃培養(yǎng)箱7-10min，直到把細胞消化成單個細胞。
3. 室溫1000rpm，離心5min，棄盡上清后用Matrigel 進行重懸，待基質膠凝固后加入上述擴增培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)基也為擴增培養(yǎng)基，接種方法如上所述。每隔兩天換一次液體。
表一：誘導培養(yǎng)用細胞因子和小分子
品牌
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產品編號
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產品名稱
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規(guī)格
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PeproTech
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120-14
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Human/Murine/Rat Activin A
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2μg/10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1000μg
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PeproTech
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120-05ET
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Human BMP-4
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2μg/10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1000μg
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PeproTech
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100-18B
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Human FGF-2
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20μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1000μg
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PeproTech
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AF-100-15
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Human EGF
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100μg/500μg/1000μg
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PeproTech
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120-38
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Human R-spondin-1
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5μg/20μg/100μg/250μg/500μg/1000μg
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PeproTech
|
315-20
|
Murine WNT-3A
|
5μg/10μg
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BioGems
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1293823
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Y-27632
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1mg/10mg
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BioGems
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1003377
|
Gastrin I
|
1mg
|
BioGems
|
9094360
|
A 83-01
|
10mg/25mg
|
BioGems
|
6652995
|
Forskolin
|
10mg/50mg
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BioGems
|
9899208
|
Nicotinamide
|
50mg/100mg
|
BioGems
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6169116
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N-Acetyl-L-cysteine
|
10g/100g
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