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人肝臟干細(xì)胞來(lái)源肝臟類器官的培養(yǎng)方法

發(fā)布時(shí)間：2024-04-24

2014 年Hans.Clever 團(tuán)隊(duì)從手術(shù)切除的原代肝組織中分離細(xì)胞并通過(guò)表面標(biāo)記EPCAM 篩選細(xì)胞，使用細(xì)胞外基質(zhì)膠Matrigel，結(jié)合細(xì)胞因子和小分子化合物的三維類器官培養(yǎng)方法成功的在體外大量擴(kuò)增了具有雙向分化潛能的肝臟干細(xì)胞，本文總結(jié)了具體的操作方案。

一、實(shí)驗(yàn)材料

1. Advanced DMEM/F12培養(yǎng)基（Thermo, Cat#12634010），
2. Matrigel類器官培養(yǎng)用基質(zhì)膠(Corning, Cat#356231)，于冰上分裝后保存于-80℃，
3. B-27? Supplement (50X) (Thermo, Cat#17504044), 分裝后保存于-20℃，
4. N-2 Supplement (100X) (Thermo, Cat#17502001), 分裝后保存于-20℃，
5. R-spondin-1（PeproTech， Cat#120-38）配制為250μg/ml，保存于-80℃，使用終濃度為250ng/ml，
6. Wnt-3a（PeproTech， Cat#315-20）配制為50μg/ml，保存于-80℃，使用終濃度為50ng/ml，
7. HGF（PeproTech， Cat#100-39）配制為25μg/ml，保存于-80℃，使用終濃度為25ng/ml，
8. FGF-10（PeproTech， Cat#100-26）配制為100μg/ml，保存于-80℃，使用終濃度為100ng/ml，
9. Noggin（PeproTech， Cat#120-10C）配制為25μg/ml，保存于-80℃，使用終濃度為25ng/ml，
10. EGF（PeproTech， Cat#AF-100-15）配制為50μg/ml，保存于-80℃，使用終濃度為50ng/ml，
11. Y-27632 (BioGems, Cat# 1293823)配制為10mM, 保存于-80℃，使用終濃度為10μM，
12. Forskolin (BioGems, Cat# 6652995)配制為10mM, 保存于-80℃，使用終濃度為10μM，
13. N-Acetyl-L-cysteine (BioGems, Cat# 6169116)配制為1.25M, 保存于-80℃，使用終濃度為1.25mM，
14. A83-01 (BioGems, Cat# 9094360)配制為5mM, 保存于-80℃，使用終濃度為5μM，
15. Gastrin I (BioGems, Cat# 1003377)配制為10μM, 保存于-80℃，使用終濃度為10nM，
16. Nicotinamide (BioGems, Cat#9899208)配制為10M, 保存于-80℃，使用終濃度10mM，
17. Accutase消化液(Thermo, Cat#A1110501)。

二、肝臟組織的消化

外科手術(shù)獲取的病人肝臟組織（~1cm3）眼科剪將其剪碎至1mm3大小，膠原酶消化分離肝細(xì)胞如下:組織(0.5-1cm3)切碎，用含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，在EBSS緩沖液中加入2.5 mg/ml的膠原酶D和0.1 mg/ml的DNase I配置肝組織消化液， 37℃孵育20~40min后加入含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基停止消化，然后用70μm尼龍細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾懸浮液，過(guò)濾液以300-400 g離心5min。細(xì)胞沉淀用1%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，放冰上。濾器膜上剩余的組織碎片加入Accutase 消化液再37℃進(jìn)一步消化10分鐘。然后加入含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基停止消化，像上述步驟一樣收集重懸細(xì)胞。將兩種不同組分的細(xì)胞懸液混合。

三、肝臟細(xì)胞的分離：

將上述收集的細(xì)胞重懸至1*107/ml，按1:100 加入Anti-Human CD326 (EpCAM) Alexa Fluor®488抗體，4℃孵育30min，加入1%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞300-400 g離心5min，棄去上清后用加入1%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞分選儀對(duì)CD326陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分選。

四、肝臟類器官的培養(yǎng)

將上述分選后細(xì)胞放冰上用基質(zhì)膠重懸，注意不要打出氣泡，吸取50μl基質(zhì)膠于48孔培養(yǎng)板內(nèi)，使每孔接種3000 - 10000個(gè)細(xì)胞，放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置10min，待基質(zhì)膠凝固后加入500ul肝類器官培養(yǎng)基，肝類器官培養(yǎng)基配置：

Advanced DMEM/F12+1X N2+1XB27++R-spondin1(250ng/mL)+ EGF(50ng/mL)+ FGF10 (100ng/ml)1+ HGF(25ng/ml)+%Glutamax+N-Acetyl-L-cysteine(1.25mM)
+Gastrin(10nM)+ Nicotinamide(10mM) +A83-01(5μM)+Forskolin(10μM)+ Noggin(25ng/ml)+ Wnt3a(25ng/ml)+ Y-27632(10μM), 培養(yǎng)三天后更換類器官培養(yǎng)基，不需要添加Noggin(25ng/ml)+ Wnt3a(50ng/ml)+ Y-27632(10μM)。此后隔天換液，培養(yǎng)7~10天后肝類器官可以成熟。

五、肝類器官的傳代

待細(xì)胞培養(yǎng)10天左右可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，按1：4~1：8比例進(jìn)行傳代，先在原孔內(nèi)機(jī)械法把細(xì)胞吹成小塊，然后把細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL 離心管，室溫300g，離心5min，棄去上清，添加Accutase，置于37℃培養(yǎng)箱7-10min，直到把細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞。室溫300g，離心5min，棄盡上清后用Matrigel 進(jìn)行重懸，待基質(zhì)膠凝固后加入上述類器官培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔天換一次液體。需要留意的是前三天需要用含Y-27632(10μM)的類器官培養(yǎng)基培養(yǎng)，后續(xù)培養(yǎng)無(wú)需添加Y-27632(10μM)。

表一：誘導(dǎo)培養(yǎng)用細(xì)胞因子和小分子

品牌	產(chǎn)品編號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格
PeproTech	120-38	Human R-spondin-1	5μg/20μg/100μg/250μg/500μg/1000μg
PeproTech	AF-100-15	Human EGF	100μg/500μg/1000μg
PeproTech	100-26	Human FGF-10	5μg/25μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1000μg
PeproTech	100-39	Human HGF	2μg/10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1000μg
PeproTech	120-10C	Human Noggin	5μg/20μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1000μg
PeproTech	315-20	Murine WNT-3A	5μg/10μg
BioGems	1293823	Y-27632	1mg/10mg
BioGems	1003377	Gastrin I	1mg
BioGems	9094360	A 83-01	10mg/25mg
BioGems	6652995	Forskolin	10mg/50mg
BioGems	9899208	Nicotinamide	50mg/100mg
BioGems	6169116	N-Acetyl-L-cysteine	10g/100g

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