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一、 分離小鼠結腸隱窩

1、腹腔麻醉后采用頸椎脫臼法處死小鼠，浸泡于體積分數為 75%的酒精中 5 min；解剖小鼠取結腸 5cm（結腸取材應從盲腸下方 0.5 cm，直腸上方 0.5 cm 位置截取），將腸段放入 10cm 培養皿中，里面提前加入預冷（2~8 ℃）的 10ml DPBS 溶液;
2、使用鈍頭剪刀將腸段縱向剖開，用彎鑷刮去腸壁上附著的糞便殘渣，加入 DPBS 溶液徹底沖洗腸段；用手術刀將腸切成4 mm左右的小段，轉移至50 mL離心管中用預冷DPBS溶液反復清洗 10 次以上（可選擇性加入雙抗和兩性霉素 B）；
3、加入 10 mL 消化液（DMEM 加入 1% FBS，加入 500U/ml collagenase XI，0.4U/ml dispase 和 1 mM DTT），37℃水浴消化 15~25min；
4、自然沉降細胞后，吸去消化液，留有管底的細胞和組織碎片，加入 10 mL 含有質量分數 0.1% BSA 的冰 DPBS 溶液，用巴氏吸管吹打重懸 3 次，待其自然沉降后，收集上清液并標記為“上清 1”，重復上述操作，分別獲得“上清 2-8”；吸取各上清組分 1mL 到 12 孔板中，鏡檢，選取細胞碎片與雜質少的上清組分合并到一管，其余上清組分舍棄，并用 70μm 的細胞篩網過濾合并上清液，4℃ 200 g/min 離心 5 min，小心棄去上清，留在管底的沉淀即為小鼠結腸隱窩。

二、 分離的小鼠結腸隱窩類器官培養

1、向獲取的隱窩沉淀中加入 10 mL 冰 DMEM/F12 培養基重懸；取出 10 μl 滴加于載玻片上計數隱窩，以 24 孔板為例，每孔含 500 個隱窩;
2、取出相應數量的隱窩懸液，離心去除干凈上清后，用未經稀釋的 Matrigel® 基質膠重懸隱窩到對應體積，吸取 50 μl 混懸液，加入提前 37℃預熱的 24 孔板的孔中心部位，將培養板在 37 ℃下靜置 10 min 以待 Matrigel®完全凝固；
3、 使用移液槍沿著孔側壁向每個孔中輕輕地加入 500 μl 預熱的配置好的類器官生長培養基，其他未接種孔加入無菌 PBS，以保持培養板內部濕度，將培養板放入培養箱中培養，每隔兩天進行換液。

結腸類器官完全培養基

品牌	產品編號	產品名稱	推薦濃度
Gibco	12634028	Advanced DMEM/F12 ()	500 mL
Gibco	25030081	L-Glutamine (200 mM)	2mM
Gibco	15630080	HEPES (1 M)	10mM
Gibco	17504044	B-27? Supplement (50X)	1X
Gibco	17502001	N-2 Supplement (100X)	1X
PeproTech	315-09	Murine EGF	30ng/ml
PeproTech	250-38	Murine Noggin	50ng/ml
PeproTech	315-32	Murine R-Spondin-1	500ng/ml
PeproTech	315-23	Murine HGF	50ng/ml
PeproTech	315-20	Murine Wnt3a	30ng/ml
BioGems	6169116	N-Acetyl-L-cysteine	1.25mM
BioGems	1293823	Y-27632 (hydrochloride)	10uM
Corning	356231	Matrigel 基質膠低生長因子 無酚紅

三、小鼠結腸類器官的傳代

1、當小鼠結腸類器官出芽明顯，即可以進行傳代處理，棄去原有培養基，每孔加入 1 mL 冰DPBS 溶液，吹散凝固的基質膠，收集到 15mL 離心管中，多個孔可合并處理，收集完后用移液器吹打混勻懸液，通過機械力分離成熟類器官出芽部分；4℃ 300gr/min 離心5min;

2、小心去除上清液，加入 10 mL 冷 DMEM/F 12 培養基重懸沉淀；4℃ 300gr/min 離心 5min，小心去除干凈上清液，按一個孔收集的類器官接種到兩個孔中的比例傳代，后續操作與結腸隱窩細胞接種步驟相同，在傳代培養的前 2 天培養基需要加入 10μM的 Y-27632 小分子化合物，可以增加類器官的存活率。

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