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2009年，荷蘭科學(xué)家Hans Clevers的團(tuán)隊(duì)成功地在體外將Lgr5+腸道干細(xì)胞培養(yǎng)成包括隱窩樣區(qū)域和絨毛樣上皮區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)，即小腸類器官，這一結(jié)構(gòu)包含所有終末分化細(xì)胞類型，能準(zhǔn)確模擬腸道上皮生理情況，這一方法的建立既實(shí)現(xiàn)了腸上皮長期體外培養(yǎng)又可以維持腸上皮細(xì)胞原始分化能力，該技術(shù)已經(jīng)逐漸被應(yīng)用于干細(xì)胞、疾病模型以及再生藥物等相關(guān)研究。小腸類器官的培養(yǎng)可以通過多能誘導(dǎo)干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞來誘導(dǎo)分化，也可以取小腸的隱窩干細(xì)胞來誘導(dǎo)分化，目前大多數(shù)研究都是采用小腸隱窩干細(xì)胞來培養(yǎng)，因?yàn)樵摲椒ú粌H獲取干細(xì)胞方便，技術(shù)要求不高，而且培養(yǎng)的類器官傳代次數(shù)更多，可以在體外長期培養(yǎng)長達(dá)2個月之久。

在進(jìn)行小腸類器官培養(yǎng)時需要將整個隱窩結(jié)構(gòu)或者單個Lar5+干細(xì)胞種植到基質(zhì)膠中，然后利用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有三種必須的細(xì)胞因子，即R-spondin1、EGF、Noggin。其中 R-Spondin1是Wnt通路的激動劑，同時也是Lgr5的配體，在體內(nèi)可以導(dǎo)致隱窩的大量增殖;EGF與受體結(jié)合可以促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞的增殖:Noaain是BMP通路的抑制劑，可以增加類器官中隱窩的數(shù)量。通過這種方法培養(yǎng)出來的類器官，可以得到上皮細(xì)胞緊密連接形成中空的管腔樣結(jié)構(gòu)，腔內(nèi)有凋亡脫落下的細(xì)胞。隨著類器官的生長，干細(xì)胞可通過出芽的方式向外突出生長形成更多的隱窩狀結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)的類器官中含有各種腸道細(xì)胞，目各細(xì)胞比例與體內(nèi)一至，潘氏細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞也可以向腔內(nèi)分泌物質(zhì)，吸收細(xì)胞也具備吸收功能。

小腸類器官的制備方法

1、將小鼠斷頸處死后，收集自末端回腸起約15cm腸斷，置于冰的PBS 洗滌液液中，使用尖頭鑷子去除腸道外部的膜、血管和脂肪，用注射器從小腸一端注入PBS進(jìn)行沖洗；
2、使用小剪刀，將腸段縱向切開，腸腔朝上打開。用冰冷的PBS（2-8℃）輕輕洗滌切開的腸道片段，用玻片刮出腸管內(nèi)容物和絨毛結(jié)構(gòu)，再次用冰冷的PBS沖洗；
3、向50 mL離心管中加入15 mL冰冷的PBS。用鑷子夾住腸道一端，并懸在管口上。從腸道底部開始，用剪刀將腸切成1~2毫米的小片，讓這些碎片落入管內(nèi)的緩沖液中；
4、用PBS預(yù)先潤濕10 mL移液管，加入15 mL冰冷的PBS清洗腸道碎片5~10次，直至上清液變澄清(見圖1)；
5、除去上清液，將組織碎片重懸于 25 mL 小腸隱窩消化液中，在冰上孵育 20min，冰盒置于 20rpm 轉(zhuǎn)速搖床上旋轉(zhuǎn) 30 min；小腸隱窩消化液：2-5 mM的EDTA, 此步驟后可以讓組織碎片自然沉降后去除上清，繼續(xù)消化一次。
6、讓組織碎片通過重力沉降約1 min。小心吸出并丟棄消化液，留下足夠的液體以沒過組織碎片；
7、將組織碎片重懸于 10 mL10%FBS 冷的 (2-8℃)PBS 緩沖液，并用移液管上下吹打三次。靜置直到大部分腸組織碎片沉降到底部 ( 見圖 2)；
8、小心吸取上清液并使用 70 μm 濾網(wǎng)過濾，將濾液收集于干凈的 50 mL 管中；
9、重復(fù)上述 7-8 步驟二次，將獲得的三份過濾液混合；
10、在 2-8 ℃下將上述混合液以 290×g 離心 5 分鐘。小心地倒出并丟棄上清液；
11、將沉淀重懸于含有 10 mLPBS 緩沖液中。200×g 離心 3 分鐘。輕輕倒出上清液。將腸隱窩沉淀留在管中。根據(jù)沉淀量加入適當(dāng)體積的基礎(chǔ)培 養(yǎng) 基 重 懸 沉 淀，如 果 單 細(xì) 胞 過 多，可 200 r/min 離心 2 min 收集上清以去除單細(xì)胞；
12、計(jì)數(shù)，吸取 10 μL 置于玻璃載玻片或血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上。使用倒置顯微鏡，計(jì)數(shù) 10 μL 樣本中的隱窩數(shù)量，200 g 離心 5 min，小心吸出并棄去上清；

配置類器官培養(yǎng)基

培養(yǎng)基中加入的組分及工作濃度

N2 Supplement	1x
B27 serum-free supplement	1x
Murine EGF	100 ng/mL
Murine R-spondin 1	200 ng/mL
Murine Noggin	100 ng/mL
N–acetylcysteine	1 mM

注：基礎(chǔ)培養(yǎng)基應(yīng)為 Advanced DMEM-F12( 含有10mM HEPES、L- 谷氨酰胺 )

圖1：小腸組織清洗澄清后的上清液                                                                   圖2：吹打后的小腸上清液，含有小腸隱窩

13、用類器官培養(yǎng)基將隱窩的密度重懸至 8-20個 /μL，取出 150 μL 隱窩懸液，加入等體積的未稀釋的基質(zhì)膠混合隱窩，小心地上下吹打十次以充分混勻，注意避免產(chǎn)生氣泡；
14、吸取 50 μL 懸液，加入到提前預(yù)熱的 24 孔板每個孔中的中心部位，樣品應(yīng)在每個孔的中心形成圓頂結(jié)構(gòu)。為了防止接種時出現(xiàn)氣泡，槍頭內(nèi)液體不要全部打出；
15、將培養(yǎng)板在 37℃下靜置 10 分鐘以待基質(zhì)膠完全凝固。將平板轉(zhuǎn)放入培養(yǎng)箱時，應(yīng)注意不要破壞凝固后的液滴；

圖3：基質(zhì)膠種板后的形成的液體

16、使用移液槍沿著孔側(cè)壁向每個孔中輕輕地加入 500 μL 配置的類器官培養(yǎng)基，室溫 (15-25℃)。不要將培養(yǎng)基從圓頂結(jié)構(gòu)上直接加入；
17、向其它未接種的孔中加入無菌 PBS 以保證培 養(yǎng) 時 的 濕 度。將培養(yǎng)板的蓋子蓋好，并在37 ℃和5％CO2 下進(jìn)行培養(yǎng)；
18、觀測類器官生長情況。通常，隱窩開始培養(yǎng)約 3 小時后形成球狀結(jié)構(gòu)，通常在培養(yǎng) 2 至 4 天后，小腸類器官開始出芽，并且在第 5 至 7 天形成復(fù)雜的出芽狀結(jié)構(gòu)；
19、隔天進(jìn)行完全換液。換液時將移液槍頭放在孔底邊緣小心地將原有液體培養(yǎng)基吸出，并加入500 μL 新鮮的室溫類器官培養(yǎng)基。

圖4：培養(yǎng)10天后的小腸類器官

小腸類器官培養(yǎng)注意事項(xiàng)

1、腸道外部的膜、血管和脂肪，盡量去除干凈，否則后續(xù)得到的分餾會有很多雜細(xì)胞污染；
2、用注射器往腸腔內(nèi)注入 PBS，沖洗掉小腸內(nèi)容物，可以減少后續(xù)洗滌時間；
3、用無菌的載玻片刮去小腸內(nèi)絨毛組織，盡量去除干凈，可以減少雜細(xì)胞的產(chǎn)生，另外可以有助于小腸組織的消化，得到更多的小腸隱窩；
4、小 腸 隱 窩 消 化 液 用 5 mM 的 EDTA，注意EDTA 是否有析出，如析出太多會影響終濃度，有必要更換新的 EDTA；
5、因分離小腸隱窩需要時間較久，建議整個操作在低溫進(jìn)行，離心機(jī)調(diào)至 4℃，PBS 放冰上。試用移液器前用冷的 PBS 潤洗移液器槍頭；
6、EDTA 消化后，小腸組織會變松散，在外界機(jī)械力作用下，小腸隱窩會從組織中分離出來，可以重復(fù)幾次通過外界機(jī)械力作用得到不同的分餾組分，可以挑選隱窩含量較高，雜細(xì)胞較少的分餾組分種板培養(yǎng)；
7、得到分餾組分后進(jìn)行隱窩計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基重懸隱窩至 8~20 個 /μL，加入等體積基質(zhì)膠混合，該過程一定要在冰上操作，混合過程切勿產(chǎn)生氣泡，否則影響后續(xù)觀察以及隱窩培養(yǎng)狀態(tài)，混勻過程可以調(diào)小量程，吸取的液體不要全部吹出；
8、購買的基質(zhì)膠在冰上融化后分裝凍存，操作過程中基質(zhì)膠一定要放在冰上，未用完的液體狀基質(zhì)膠可以凍存，若凝固后請棄去。
9、基質(zhì)膠種板前需要將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱溫浴30min，拿出培養(yǎng)板后盡快種板，以便形成更好的基質(zhì)膠圓頂結(jié)構(gòu)。

小腸類器官的傳代培養(yǎng)

1、在成熟類器官的24孔板中，每孔加入約1000基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用1mL 槍頭吹打板底的基質(zhì)膠，直到基質(zhì)膠全部打碎，收集每個孔中的懸液置于15 mL離心管中；
2、將全部打碎的基質(zhì)膠懸液冰上放置 5 ～10min；可用 1 mL 大槍頭繼續(xù)吹打懸液，此過程避免產(chǎn)生氣泡（調(diào)制量程到 700 μL 可避免氣泡產(chǎn)生），可取適量的懸液觀察，直至看不到大塊的類器官團(tuán)塊為止；

圖5：小腸隱窩干細(xì)胞在基質(zhì)膠中培養(yǎng)7天結(jié)果

圖6：小腸類器官傳代在基質(zhì)膠中培養(yǎng)3天結(jié)果

注：此過程也可將全部打碎的基質(zhì)膠懸液吸入胰島素注射器內(nèi)，再將懸液通過胰島素注射器針頭打出，通過機(jī)械力將類器官團(tuán)塊分離。
傳代中，若隱窩狀態(tài)良好可進(jìn)行 1:3 傳代，若狀態(tài)較差可進(jìn)行 1:1 傳代。全程可以維持約 3 個月的長期傳代擴(kuò)增，且類器官狀態(tài)保持良好。

小腸類器官的凍存與復(fù)蘇

準(zhǔn)備凍存液：10％二甲基亞砜 (DMSO)+20％胎牛血清 (FBS)+70％DMEM/F12
1、將需要凍存的類器官冰上放置 5 ～ 10 min；
2、收集類器官，步驟同之前傳代收集步驟一致；
3、離心后棄上清，用 800μl 的凍存培養(yǎng)液重懸，將懸液移至凍存管中，放入凍存盒中于 -80℃冰箱中保存 24 h，如需長久保存，則 24h 后轉(zhuǎn)移至液氮罐保存。
復(fù)蘇準(zhǔn)備：37 ℃水浴箱
從液氮中取出凍存管后，立即放入 37 ℃水浴中，使之迅速融解。等到凍存管中僅存一小片冰室，迅速將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含 9 mL 冷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中 ( 先將之置于 15 mL 離心管中，放于冰上 )。200 g室溫離心 5 min，棄去上清，加入適量類器官培基重懸后與基質(zhì)膠混合種板，待基質(zhì)膠凝固后加入類器官培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱。

小腸類器官培養(yǎng)用相關(guān)試劑

品牌	貨號	產(chǎn)品名稱	使用濃度	規(guī)格
BioGems	6169116	N-Acetyl-L-cysteine	1 mM	10 g/100g
PeproTech	315-09	Murine EGF	100 ng/mL	100 μg/500 μg/1mg
PeproTech	250-38	Murine Noggin	100 ng/mL	5 μg/20 μg/50 μg/100 μg/250 μg/500 μg/1mg
PeproTech	315-32	Murine R-Spondin-1	200~500 ng/mL	5 μg/20 μg/50 μg/100 μg/250 μg/500 μg/1mg

小鼠小腸類器官培養(yǎng)操作視頻參考：

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