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小鼠胃類器官的培養

發布時間：2024-04-24

胃類器官是一種衍生于胃干細胞或者多能誘導干細胞的類器官模型，體外培養的胃類器官含有多種細胞克隆亞群，其培養環境模擬活體內的真實微環境，因此胃類器官在細胞成分、組織構架及特定功能等方面與胃上皮組織高度相似，可實現在體外培養環境中對胃上皮組織的復制，為人類胃生理與疾病的研究提供了一個新的平臺。胃上皮類器官培養的原理就是3D環境下培養胃上皮干細胞，加入生長因子和小分子刺激干細胞自發分裂、分化形成球囊狀結構。胃上皮腺體可分為胃底/體腺和胃竇/幽門腺兩部分，胃底腺和胃竇腺均可構建胃上皮類器官，其中含有的細胞成分與各自上皮一致。胃類器官是一種非常好的基礎實驗模型，目前已被應用于胃的形成與生理、幽門螺桿菌感染相關疾病、胃疾病的致病基因研究、藥物篩選與開發以及再生醫學等領域。

胃類器官的制備方法

1、小鼠腹腔麻醉后以頸椎脫臼法處死，剖腹，分離胃移至置于冰上的培養皿中。

2、沿胃大彎側剪開胃壁，冰 PBS 沖洗并分離胃體部。去除胃肌層，將剩下的上皮層剪成直徑小于 2 mm 大小的碎片。用 10 ml 的移液管將組織碎片的移至 15 ml 離心管中，添加 10 ml 冰 PBS反復吹打重懸，然后讓組織碎片自然沉降于管底，棄去約 7.5 ml 的上清。

3、重復該重懸清洗步驟 5～10 次至上清液清亮，棄上清。
4、最后一次漂洗后，吸除大部分上清液，向沉淀中加入含 10 mM EDTA 溶液 (25 ml) 室溫消化60 min 后，棄上清。
5、加入 10 ml 冰 PBS 用移液管輕輕吹打幾次，等待組織塊沉淀下去，棄去上清，將組織塊轉移到 10 cm2 的培養皿中，在組織塊上覆蓋一個無菌的載玻片，戴上無菌手套，用兩手的大拇指按壓載玻片，將組織塊腺體中的細胞擠壓出來。

6、加入 PBS 反復吹打培養皿和載玻片上的組織塊，吹打后等待組織塊自然沉降，小心吸取上清液并使用 70 μm 濾網過濾，將濾液收集于干凈的50 ml 管中。
7、如果收集的細胞不夠多，可以重復5)和6)步驟，將幾份混合液以 200×g 離心 5 min。小心地倒出并丟棄上清液。

配置類器官培養基

在基礎培養基中加入(如下表所示)：

培養基中加入的組分及工作濃度

N2 Supplement	1x
B27 serum-free supplement	1x
Murine EGF	100 ng/mL
Murine R-spondin 1	200 ng/mL
Murine Noggin	100 ng/mL
Wnt -3A	100 ng/ml
FGF10	100 ng/ml
N–acetylcysteine	1 mM
Gastrin I	10 nM
Y-27632	10 μM

注：基礎培養基應為Advanced DMEM-F12( 含有 10mM HEPES、L- 谷氨酰胺 )

8、將沉淀重懸于含有冰的類器官培養基中，吸取 10 μL 置于玻璃載玻片或血細胞計數器上。使用倒置顯微鏡，計數分離的細胞數目，200 g 離心 5 min，小心吸出并棄去上清。用類器官培養基重懸細胞至 1.6 x105 個 /ml。
9、將離心管置于冰上，吸取 150 μL 重懸好的細胞懸液，加入等體積的預冷的 Matrigel，小心地上下吹打十次以充分混勻，注意避免產生氣泡。
10、吸取 50 μL 懸液，加入到提前預熱的 24 孔板每個孔中的中心部位，樣品應在每個孔的中心形成圓頂結構。為了防止接種時出現氣泡，槍頭內液體不要全部打出。分別接種 24 孔板 4 個孔。
11、將培養板在 37℃下靜置 10 分鐘以待基質膠完全凝固。將平板轉放入培養箱時，應注意不要破壞凝固后的液滴。
12、使用移液槍沿著孔側壁向每個孔中輕輕地加入500 μL室溫(15-25℃)的配置的類器官培養基。不要將培養基從圓頂結構上直接加入。
13、向其它未接種的孔中加入無菌 PBS 以保證培養時的濕度。
14、將培養板的蓋子蓋好，并在 37℃和 5％CO2下進行培養。
15、每隔 2 天進行完全換液。換液時將移液槍頭放在孔底邊緣小心地將原有液體培養基吸出，并加入為 500 μL 新鮮的室溫類器官培養基。

16、在培養第 7 至 10 天以 1:3~1:6 的比例進行類器官傳代，以避免在類器官過度生長和空腔內積累過量的碎屑。

小鼠胃類器官的傳代

1、在成熟類器官的24孔板中，每孔加入約1000 基礎培養基，使用無菌細胞刮刮取孔板中的基質膠，收集每個孔中的懸液置于 15 ml 離心管中；
2、將可以傳代的類器官冰上放置 5 ～ 10 min；用 1 ml 大槍頭吹打將基質膠打碎，吹打 30 下左右，此過程避免產生氣泡（調制量程到 700 μL可避免氣泡產生），可取適量的懸液觀察，直至大部分類器官結構解離。其后步驟同胃類器官的制備方法中 9 ～ 13。
注：傳代中，若隱窩狀態良好可進行 1:3 傳代，若狀態較差可進行 1:1 傳代。全程可以維持約 3 個月的長期傳代擴增，且類器官狀態保持良好。

小鼠胃類器官的培養注意事項

1、胃解剖上可分為胃底、胃體、胃竇、幽門（小鼠胃還擁有前胃部分），對應的胃上皮可以分為胃底 / 體腺和胃竇 / 幽門腺兩部分，兩者在細胞構成上差別較大。它們均含有表面黏液細胞、頸粘液細胞、干細胞、內分泌細胞；但胃底腺含有壁細胞（分泌鹽酸）和主細胞（分泌胃蛋白酶），而胃竇腺不含有這兩種細胞組分。胃底腺和胃竇腺均可以構建成胃上皮類器官。胃腺體內的干細胞能夠分裂、分化，自發形成球囊狀結構；囊壁上含有所有腺體內的細胞成分。囊內為上皮的腔面，內含脫落細胞、分泌物等；囊外為上皮的基底面，為細胞外基質成分。

2、EDTA 消化液需要用無鈣無鎂的 PBS 溶液進行稀釋，否則影響 EDTA 的螯合作用。

胃類器官的培養相關試劑及使用濃度

品牌	貨號	產品名稱	使用濃度	規格
BioGems	6169116	N-Acetyl-L-cysteine	1 mM	10 g/100g
BioGems	1003377	Gastrin I	10 nM	1 mg
BioGems	1293823	Y-27632	10 μM	1 mg/10 mg
PeproTech	315-09	Murine EGF	50 ng/ml	100 μg/500 μg/1mg
PeproTech	250-38	Murine Noggin	100 ng/ml	5 μg/20 μg/50 μg/100 μg/250 μg/500 μg/1mg
PeproTech	315-32	Murine R-Spondin-1	100~500 ng/ml	5 μg/20 μg/50 μg/100 μg/250 μg/500 μg/1mg
PeproTech	450-61	Murine FGF-10	100 ng/ml	5 μg/25 μg/100 μg/250 μg/500 μg/1mg
PeproTech	315-20	Murine Wnt3a	100 ng/ml	2 μg/10 μg

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