一、細胞準備篇
1、 組織消化選擇什么消化液，消化多長時間？
答：組織的消化液有兩種，一種是 EDTA, 另一種是膠原酶，EDTA 適合消化空腔性器官，例如小腸和胃；膠原酶消化應該比較廣泛，一般會搭配 DNA 酶一起使用，基本適合所有組織的消化。不同組織消化時間差異比較大，從十幾分鐘到數時小時都有。
2、 消化的溫度如何選擇？
答：EDTA 消化可以在冰上進行，膠原酶的消化需要 37℃，這樣酶的活性最高。
3、 基質膠培養之前，如何篩出干性細胞？
答：如果是單細胞，并且已知干細胞的特異性標記，可以通過流式分選或者磁珠分選。
4、 類器官的培養必須要細胞具有干性嗎？正常組織成熟體細胞可以做類器官培養嗎？
答：只有干細胞擴增來源的培養物才能稱之為類器官，因此干性是必要條件。正常組織的成熟體細胞中往往會有一部分成體干細胞( 標志物為 Lgr5，CD133 等 ), 這部分細胞可以進行類器官培養。
5、 如何選擇構建類器官的來源細胞？
答：理論上所有類器官都可以選擇從ESC/IPSC 來構建，部分類器官可以選擇從組織中分離成體干細胞來構建，成體干細胞來源的類器官其構建周期短，體外傳代次數多，相對而言構建成本低；根據實驗需求，如果要通過類器官模型來研究器官的發育，需要對起始細胞進行基因編輯，一般都是通過ESC/IPSC 來構建類器官。
二、類器官培養篇
1、 類器官培養需要多長時間？
答：如果選擇從 ESC/IPSC 來構建類器官，需要 1-2 月 ( 甚至更長 ) 才能構建成功，如果是選擇從成體干細胞來構建類器官，一般只需要 1-2 周就可構建成功。
2、 基質膠如何重懸細胞？
答：用基質膠去混細胞時，可以直接用基質膠去重懸細胞；也可以用培養基：基質膠=1:1 的比例稀釋后重懸細胞，但是不推薦更大比例稀釋基質膠，因為加入過多的培養基時，膠滴容易散開，整個重懸過程在冰上操作，重懸細胞時禁止產生氣泡。
3、 不同孔板培養類器官培養所需的基質膠和培養基？
答：類器官常用 24 孔板進行培養，一般種一個 50μl 的膠滴，加入 500μl 培養基覆蓋膠滴；6 孔板可以種多個 50μl 的膠滴，加入 2ml 培養基覆蓋膠滴；96 孔板一般種一個 10μl 的膠滴，加入 200 μl 培養基覆蓋膠滴。
4、 基質膠可否反復凍融？
答：基質膠不建議反復凍融，偶爾凍融一兩次沒問題，多次凍融會有影響，但是要注意，基質膠凝固后不建議再用了。
三、類器官傳代篇
1、類器官傳代時如何收獲類器官？如何將類器
官分散開？
答：基質膠在 4℃時會變得很軟，吹打后可將基質膠分散開，通過離心去除上清液里的基質膠，收集的類器官重懸后可通過機械力吹打進行解離；也可以選擇用 Cell recovery solution 來消化基質膠，使基質膠溶解，通過離心去除上清液里的基質膠，Cell recovery solution 對細胞團消化作用不明顯，因此更多時候類器官傳代需要使用消化酶 ( 包括胰酶 ) 消化成單細胞或小細胞團。
2、類器官傳代一般怎么傳啊？
答：先把基質膠消化掉，可以對類器官消化 ( 消化酶處理 ) 或不消化 ( 機械力吹打 )。傳代通常按照 1:2、1:3、1:4 甚至 1:10 的比例都有傳代成功的例子。需要 37℃，這樣酶的活性最高。
3、如果傳代，有沒有對第一代類器官數量的要求？
答：由于傳代過程中類器官會有損失，因此類器官傳代時對前一代理論上有一定的數量要求，如類器官數量較少、尺寸較小、活性較差等都會影響傳代培養效果。類器官傳代須在類器官數量較多，且細胞狀態較好時進行。傳代時酶解或吹打盡量輕柔以免損傷細胞。并且傳代操作時盡量避免反復操作以免造成較大的細胞損失。
四、腫瘤類器官篇
1、 腫瘤類器官的培養是否也會生成正常的類器官，是否會影響藥敏測試的結果？
答：腫瘤類器官來源即為腫瘤組織，即使存在部分正常細胞，也是腫瘤微環境的一部分，且正常細胞的干性、增殖能力弱于腫瘤細胞，因此類器官建立后其大部分細胞為腫瘤細胞，少數正常細胞基本不會影響藥敏測試。
2、 培養腫瘤類器官需要原始腫瘤組織的大小是多少？活檢樣本量足夠嗎？
答：腫瘤類器官培養所需手術組織大概需要3 顆黃豆大小以上，穿刺活檢樣本需要至少 3針，內鏡活檢至少鉗取 6 顆以上。因腫瘤異質性較大，建議可以取腫瘤組織不同部位分別進行類器官培養。
3、 腫瘤類器官培養后能否建系？
答：部分腫瘤類器官是具有長期培養和穩定傳代的能力的，這類類器官可用于建系，但不是所有類器官都可以建系。
五、類器官鑒定篇
1. 如何去鑒定培養的類器官是否成功 ?
答：看類器官大小、結構以及是否具有特殊形態。一般初次培養，最好進行 HE、免疫熒光、基因測序鑒定。
參考文獻：
1. Co-culture With Intestinal Epithelial organoids allows efficient expansion and motility analysis of intraepithelial lymphocytes ;
2. single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche ;
3. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids ;
4. Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells ;
5. Modeling human development and disease in pluripotent stem cell-derived gastric organoids ;
6. In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection ;
7. Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro ;
8. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology .
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