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引言
2009年，Hans Clevers和其實驗室的博士后Toshiro Sato用來源于小鼠腸道的成體干細胞培育出首個微型腸道類器官，掀起了類器官研究的熱潮。2011年，Sato等運用類器官技術率先建立了腫瘤類器官，他們是在小鼠結腸隱窩的培養條件的基礎上，通過調整培養環境培養人小腸和結腸的類器官，再通過進一步優化調整，從結腸腺瘤和腺癌及Barrett食管中建立腫瘤類器官模型。。癌癥患者來源腫瘤類器官模型的建立，被認為是類器官培養技術的又一重大突破，腫瘤類器官是源自腫瘤組織中腫瘤特異性干細胞通過三維組織培養形成的細胞簇，它可模擬體內腫瘤特征及腫瘤細胞異質性，該技術的建立未為癌癥研究和治療提供了可靠的模型，特別是為個性化癌癥治療開辟了新的視野。目前，科研人員通過優化各種培養條件成功產生了許多腫瘤類器官，包括結腸癌、前列腺癌、胃癌、 乳腺癌和胰腺癌、宮內膜/卵巢癌、子宮癌肉瘤、尿路上皮癌和腎癌等。與傳統腫瘤研究模型相比，腫瘤類器官可以最大程度地模擬腫瘤在體內的結構和功能，既能直觀展現腫瘤生長的過程，又能反映患者個體差異，是一種直觀、可靠、高效和避免倫理爭議的器官水平研究體系，更加適合于體外的腫瘤生物學和治療相關的研究。
表一：腫瘤類器官發展歷程表
一、腫瘤類器官的培養與鑒定
腫瘤類器官將患者腫瘤組織分離獲得的腫瘤細胞（含有腫瘤干細胞）在加入一定的細胞因子和小分子建立類似體內的微環境中進行3D培養，形成微型腫瘤模型，其具有與來源腫瘤組織相似的結構特征和功能特性, 而且能夠在體外3D培養體系中穩定擴增。腫瘤類器官的涉及到三個關鍵點，第一是取材，第二是培養方案，第三鑒定方案。
1.腫瘤類器官的取材
腫瘤類器官取材的樣本絕大部分都是選擇腫瘤組織或者腫瘤細胞，也有少部分是選擇用ips細胞誘導。對于取材樣本的要求，腫瘤組織的取樣方式包括手術，活檢，無論什么方式，我們一般要求至少采集三個不同部位，每個部位大概黃豆大小，要避免取到壞死組織，壞死組織顏色上呈現黃色，腫瘤組織樣本在取材以及運輸過程中可能會引起污染，這就要求我們在取材源頭上就要注意可能帶來的污染，同時樣本應當放在含有雙抗(青霉素-鏈霉素)的組織運送液中，在微生物陽性區域采集的樣本除了要加入雙抗外，還需要額外添加其他抗生素，例如Primocin（原代細胞抗生素）、vancomycin（萬古霉素）、gentamicin（慶大霉素）等。腫瘤組織取到后需要盡快進行處理，將樣本剪成乳糜狀，加入消化酶進行消化，這個消化方案一般是參考正常組織的消化方法，包括膠原酶，DNA酶，透明質酸等；如果是選用循環腫瘤細胞需要通過對應標記的maker進行分選；如果是腹水里面提取腫瘤細胞需要去除一些雜質細胞，建議收集300-500ml腹水，離心去除雜質，可鏡下觀察是否有腫瘤細胞。一般穿刺和內鏡活檢組織培養的成功率較低，因為不可避免會有正常細胞的污染，而在腫瘤類器官培養體系中正常細胞的增值速度是大于腫瘤干細胞。
2.誘導方案的確定
腫瘤類器官誘導培養基的調試是腫瘤類器官培養最關鍵的部分，腫瘤類器官不同于正常類器官的培養，他的誘導因子不是固定的，因為腫瘤患者本身具有個體化差異，這也導致了商品化的腫瘤類器官培養基開發極其困難。當然這個里面有些成分是固定的，誘導細胞因子也主要是以Noggin, R-Spondin, EGF為主，誘導小分子以Y-27632, N-acetyl-L-Cysteine為主，其他細胞因子和小分子根據對應的正常類器官培養方案進行組合添加篩選。
表二：細胞因子和小分子在這個過程中起的作用包括以下這些：
Wnt-R-Spondin-1信號通路激活圖（左圖單獨Wnt，無法激活，右圖Wnt+R-Spondin-1可持續激活）
3.腫瘤類器官的鑒定
腫瘤類器官的鑒定，從組織病理學進行形態結構觀察（細胞水平），腫瘤標志物的染色鑒定（蛋白水平），基因表達變化及基因突變分析（基因水平），藥敏活性測試（功能應用）這四個方面與來源腫瘤組織進行比較。培養后的腫瘤類器官需要與來源腫瘤組織保存高度一致。以下表格列出常見種類類器官的培養方案和鑒定標準。
二、腫瘤類器官的優勢
腫瘤干細胞被認為是導致腫瘤異質性的重要原因之一，腫瘤干細胞是腫瘤組織中一類具有自我更新、增殖及分化潛能的細胞群，與腫瘤形成、轉移和復發密切相關，腫瘤干細胞可分化形成與原發腫瘤中類似的異種細胞，實現了體外模型保留腫瘤異質性的目的。因此腫瘤類器官的應用主要集中在以下四個方面，抗腫瘤藥物篩選，藥物毒性測定，腫瘤類器官建庫，研究腫瘤發生發展機制，我們都知道在腫瘤類器官之前，腫瘤新藥的篩選主要依靠體外腫瘤細胞直接培養或者PDX模型，這兩種方法缺陷比較明顯，首先是2D培養很難模擬體內真實的情況，因此得到的數據參考價值不高，PDX模型雖然可以部分模擬體內的情況，但是其構建成本高，周期長，很多時候腫瘤患者等不急出結果。因此腫瘤類器官模型是目前最優選的腫瘤篩選工具。來自英國倫敦癌癥研究所的Nicola Valeri博士就在Science上發表了最新研究通過對71名已經出現轉移并且經歷了多種治療方案的晚期結腸癌和胃食道癌患者進行臨床實驗，發現類器官在預測抗癌藥物的有效性上，具有100%敏感性、93%特異性、88%陽性預測值、100%陰性預測值。腫瘤類器官還可以在抗腫瘤藥物篩選中輔助進行藥物毒性測定，篩選出最優的抗腫瘤藥物。
三、腫瘤類器官未來挑戰
但腫瘤類器官還具有一定的局限性，其中之一就是該模型中神經、血管及免疫細胞所形成的腫瘤微環境的缺乏，這就使其不能完全表現出腫瘤在體內的發生發展的全部特征，導致細胞或組織失去體內真實的腫瘤形態結構與功能，并喪失異質性。異質性是腫瘤的重要生物學特征之一，與耐藥和復發轉移密切相關，是腫瘤治療失敗的主要原因，也是腫瘤生物學體外研究結果在臨床試驗中重復率不高的主要原因之一。未來聚焦到主要可以集中在以下幾個方面：
1）提高生成效率，縮短類器官模型的培養周期，降低培養成本；
2）目前的類器官主要來源于上皮細胞，需要進一步研究非上皮類器官的培養方式；
3）目前暫無一個具有類器官的最優培養條件的標準化方案；
4）病理、基因組學、藥物敏感度等方面對類器官和腫瘤的一致性進行驗證。
類器官作為有著廣闊應用前景的技術，有著獨特的優勢，我們有理由投入更多的時間和精力來發揚它的優勢、完善不足、探索新的應用領域，相信會對未來的基礎研究和臨床診療產生積極的影響。
四、腫瘤類器官培養相關小分子和細胞因子
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