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引言
作為實驗室經典技術之一 ，免疫組織化學法（Immunohistochemistry，IHC）在惡性腫瘤的診斷研究腫瘤細胞類型的鑒定，
預后，感染的診斷，腎臟病理，淋巴病理，預測靶向治療的使用等方向具有廣泛應用，同時也可作為其他實驗技術中的輔助研究手段。接下來，
小編便給大家分享本實驗技術的詳細操作步驟并對實驗結果中的常見問題提供可能的解決思路，歡迎大家評論區進行交流，分享經驗，共同進步。
01
概念介紹
應用免疫學及組織化學的原理，即通過抗原和抗體之間的結合及呈色反應，對組織切片或細胞標本中的某些成分進行原位的定性、定位或定量的研究。
02
實驗步驟
組織標本的制備（以冰凍組織切片為例）
將錫箔紙折為高度約為 1.5 cm 的小籃，作為包埋模具。加入冷凍包埋劑，將取出的新鮮組織完全浸入冷凍包埋劑中；將包埋模具放入盛有少量（僅沒過容器底即可）2-甲基丁烷的容器中(作為過渡，可有效防止冰晶的形成)，迅速轉移容器至液氮，快凍 1-2 min，隨后轉移組織，保存于-80℃。冰凍切片機切片，機內溫度設置為-22℃，厚度為5-10μm(實驗允許范圍內盡可能薄，可有效降低組織染色過程的邊緣效應或脫片情況)。新鮮切制的切片烘片機70℃烤片2-3h，若是于-80℃冰箱取出的切片則需要放置于通風櫥室溫晾置1.5-2h，烤片或晾片結束后用雙蒸水潤洗切片以去除包埋劑，隨后使用免疫熒光固定液固定切片10-15min。
抗原修復
切片完全置于抗原修復液，微波爐高火5min加熱至沸騰，以暴露抗原位點，隨后取出自然冷卻至室溫，若時間緊張可置于自來水中加速冷卻，重復此步驟一次。
注:因加熱時會存在蒸發問題，固需隨時觀察切片情況并對抗原修復液進行及時更換或補充，確保切片完全浸入于修復液中。
阻斷
切片放入氧化阻斷液(可使用甲醇+3%過氧化氫，以去除內源性過氧化氫酶)中避光阻斷30min(至少30min，可根據實際情況適當延長至45min，減少非特異性結合)，結束后使用免疫組化筆圈出組織。
封閉
使用正常動物血清或免疫染色封閉液封閉1-2h，可適當延長時間以減少非特異性結合。
孵育一抗
一抗使用免疫熒光染色一抗稀釋液稀釋，稀釋比例具體可查看一抗說明書，需在合適范圍內摸索合適比例(若實驗材料珍貴可進行預實驗摸索合適濃度，避免浪費)，4℃孵育過夜。
注:抗體滴加前需保證切片已干燥無水分殘留，避免因水分殘留而導致組織抗體孵育不均勻,最終致使染色不均。
孵育二抗
滴加酶標記二抗(一般無需稀釋直接使用,注意使用時核對種屬是否正確)，室溫孵育45min。
顯色
按照說明書推薦的比例配置DAB工作液，吹打混勻后滴加于組織切片進行顯色，需注意DAB顯色液需現用現配，建議可將玻片放置于白紙上再進行滴加DAB工作液，以便于及時觀察組織顏色變化，出現棕黃色反應時及時將玻片放入單蒸水中潤洗，隨后晾干中性樹膠封片，正置顯微鏡觀察并拍照。
03
實驗結果常見問題及解決方案
問題可分為三類：陰性結果（即無陽性信號）,非特異性染色（有陽性信號）和著色不均
陰性結果
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可能原因 解決方案 |
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抗體質量存在問題 |
更換高質量、品質有保障的抗體 |
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抗體濃度 |
進行預實驗摸索抗體使用濃度 |
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抗原修復不全 |
更換合適的抗原修復方式及修復時間 |
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封閉時間過長 |
減少封閉時間 |
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DAB孵育時間短 |
鏡下控制顯色時間 |
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細胞通透不充分，抗體未能進入 |
選擇合適的通透劑及其反應時間 |
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抗原豐度 |
正常陰性 |
非特異性染色
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可能原因 解決方案 |
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抗體質量存在問題 |
更換高質量、品質有保障的抗體，盡量使用單克隆 抗體 |
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抗體抗體濃度過高或孵育時間過長 |
降低抗體濃度和孵育時間 |
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切片在緩沖液中浸泡過久 |
抗原修復之后及時封閉不可浸泡過夜 |
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存在內源性過氧化物酶及生物素 |
延長滅活時間 |
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封閉時間不足 |
延長封閉時間 |
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DAB孵育時間過久或濃度過高 |
按說明書配置，并及時于鏡下觀察控制反應時間 |
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抗體孵育后洗滌不充分 |
每次孵育之后洗3*5次 |
著色不均
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可能原因 解決方案 |
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組織切片厚度不均勻 |
切片時更換刀片并重新調整切片機參數 |
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試劑配制時未混勻，濃度不均一 |
試劑充分混勻后進行滴加 |
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試劑未完全覆蓋組織 |
滴加試劑時保證試劑可完全覆蓋組織 |
04
高質量抗體品牌推薦
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參考文獻
[1].Jensen, Ellen C . Quantitative Analysis of Histological Staining and Fluorescence Using ImageJ[J].
The Anatomical Record, 2013, 296(3):378-381.
[2].Varghese F, Bukhari A B, Malhotra R, et al. IHC Profiler: An Open Source Plugin for the Quantitative Evaluation
and Automated Scoring of Immunohistochemistry Images of Human Tissue Samples[J]. Plos One, 2014, 9(5):e96801.
