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流式細(xì)胞儀是免疫學(xué)研究的重要檢測(cè)儀器，儀器價(jià)值高，檢測(cè)參數(shù)多，初學(xué)者不易掌握。本文主要探討流式檢測(cè)中經(jīng)常忽視并且容易混淆的流式參數(shù)A, H, W。流式細(xì)胞儀檢測(cè)信號(hào)時(shí)，每一個(gè)細(xì)胞通過(guò)激光，儀器都會(huì)檢測(cè)到一個(gè)光信號(hào)，由PMT（光電倍增管）放大將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電脈沖信號(hào)，從細(xì)胞進(jìn)入檢測(cè)點(diǎn)，到細(xì)胞離開(kāi)檢測(cè)點(diǎn)，電脈沖信號(hào)由0到達(dá)峰值，再降為0，被記錄成一個(gè)峰值， H是電脈沖信號(hào)的高度（H, height），代表脈沖信號(hào)的峰值，W是脈沖信號(hào)的寬度（W, width），指細(xì)胞通過(guò)激光檢測(cè)區(qū)域的時(shí)間，H和W是直接檢測(cè)出來(lái)的，A指的電脈沖信號(hào)的面積（A, area），是經(jīng)過(guò)儀器設(shè)置計(jì)算處理的。由于A是通過(guò)W和H的數(shù)值計(jì)算出來(lái)的，在儀器上分辨率會(huì)更高。
圖1：流式參數(shù)A, H, W產(chǎn)生過(guò)程
通常我們會(huì)選擇這三個(gè)信號(hào)中的兩個(gè)，用來(lái)分析數(shù)據(jù)時(shí)去除黏連體，排除干擾，黏連的細(xì)胞通過(guò)檢測(cè)區(qū)域的時(shí)間更長(zhǎng)，脈沖面積也更大。如圖2所示，使用FSC-A和FSC-H來(lái)去除黏連體，對(duì)角線位置上的是單細(xì)胞（2倍體和4倍體通過(guò)激光檢測(cè)口時(shí)，H和A是成正比增大的，兩者之間應(yīng)該是呈45度角分布；而粘連體通過(guò)時(shí)，H不變，A增大），紅色虛線框內(nèi)面積更大的是黏連體。若用FSC-A或者FSC-H與FSC-W組合來(lái)去除黏連體時(shí)，黏連體通過(guò)FSC-W較小的一群細(xì)胞來(lái)分析（圖3）。流式細(xì)胞儀采集或細(xì)胞分選單細(xì)胞數(shù)據(jù)時(shí)，黏連體不能用于分析或分選，因?yàn)樗麄儫o(wú)法確定每個(gè)熒光標(biāo)記的真實(shí)狀態(tài)。如果黏連體太多，除了對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，還會(huì)造成儀器管路的堵塞。在進(jìn)行細(xì)胞周期分析時(shí)，黏連體會(huì)默認(rèn)為分裂的細(xì)胞，若在分析時(shí)不去除，會(huì)導(dǎo)致G2M期細(xì)胞比例上升，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
圖2：FSC-A和FSC-H去除黏連體
除了FSC，其他每一個(gè)通道（熒光通道）都有這三個(gè)參數(shù)可以記錄。那么，在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)應(yīng)該選擇熒光通道的哪個(gè)參數(shù)呢？由于熒光信號(hào)的面積（A）是采用對(duì)熒光光通量進(jìn)行積分測(cè)量，通常反映的是細(xì)胞熒光的總和，熒光信號(hào)的高度（H）取決于每個(gè)細(xì)胞熒光的表達(dá)量，通常反映的是細(xì)胞單位面積上的熒光濃度，熒光信號(hào)的寬度（W）取決于細(xì)胞的大小，細(xì)胞越大，細(xì)胞通過(guò)激光檢測(cè)區(qū)域的時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)寬度越大，由于熒光信號(hào)的寬度對(duì)熒光信號(hào)的結(jié)果不產(chǎn)生直接影響，因此一般在流式細(xì)胞儀上熒光信號(hào)默認(rèn)只收集了熒光信號(hào)的高度（H）和面積（A），通常熒光信號(hào)的面積（A）要比熒光信號(hào)的寬度（H）高一些(如圖4所示)。臨床和科研中使用A的時(shí)候比較多，特別在DNA多倍體測(cè)定時(shí)一定要使用A（這是因?yàn)闊晒饷}沖的面積比熒光脈沖的高度更能準(zhǔn)確反映 DNA 的含量，當(dāng)形狀差異較大，而 DNA 含量相等的兩個(gè)細(xì)胞，得到的熒光脈沖高度是不等的，而經(jīng)過(guò)對(duì)熒光信號(hào)積分后，所得到的信號(hào)值就相等），此外做熒光分辨率、熒光靈敏度等性能測(cè)試時(shí)也使用A。不過(guò)臨床應(yīng)用中的一些實(shí)驗(yàn)也顯示，使用H時(shí)對(duì)于弱熒光細(xì)胞的辨識(shí)是有優(yōu)勢(shì)的，因此選用H也是可以的。通常情況下可以用其中的任何一個(gè)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求來(lái)作圖，儀器軟件就會(huì)根據(jù)設(shè)置顯示出最終的圖形了。但是要注意的是如果做雙色分析的A和H 的選擇要一致。
圖4PE熒光信號(hào)分別用H和A顯示
