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      我們都知道流式細(xì)胞儀是非常重要的免疫學(xué)研究檢測(cè)儀器，其檢測(cè)的原理是在儀器的液流系統(tǒng)的作用下將流體樣品內(nèi)的細(xì)胞單個(gè)通過(guò)儀器的光學(xué)系統(tǒng)，由不同激發(fā)光源對(duì)細(xì)胞及其熒光進(jìn)行激發(fā)，激發(fā)出的光信號(hào)通過(guò)濾光片分揀后進(jìn)入對(duì)應(yīng)的檢測(cè)通道，最后由儀器的電子系統(tǒng)進(jìn)行處理，通過(guò)光電倍增管（PMT）將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)并進(jìn)行放大成相應(yīng)的電信號(hào)參數(shù)，由儀器軟件計(jì)算處理后生成最終的流式檢測(cè)圖。在我們處理好流式檢測(cè)樣品上機(jī)時(shí)，第一步要做的是調(diào)節(jié)每個(gè)通道的電壓，電壓調(diào)節(jié)準(zhǔn)確不僅會(huì)使待測(cè)細(xì)胞的熒光通道范圍合理，而且會(huì)讓多色熒光染色的補(bǔ)償調(diào)節(jié)更簡(jiǎn)單。那么電壓如何進(jìn)行調(diào)節(jié)呢？

電壓調(diào)節(jié)的作用？

流式細(xì)胞儀中每個(gè)通道信號(hào)的強(qiáng)度可通過(guò)調(diào)節(jié)光電倍增管的電壓來(lái)改變，這是因?yàn)闊晒鈽?biāo)記的細(xì)胞在穿過(guò)激光光路會(huì)產(chǎn)生電壓脈沖，電壓脈沖的大小也取決于PMT管的電壓，通過(guò)增加PMT管的電壓，可以制造更強(qiáng)的電流，從而產(chǎn)生放大增益和放大信號(hào)的效果，從PMT輸出的電信號(hào)需要經(jīng)過(guò)放大后才能輸入儀器分析。流式細(xì)胞儀中一般備有兩類放大模式，一類是線性放大，其輸出信號(hào)與輸入信號(hào)成線性關(guān)系，在檢測(cè)細(xì)胞DNA、RNA含量，總蛋白含量時(shí)使用，因?yàn)檫@些指標(biāo)細(xì)胞之間的差異變化不大，線性顯示可以滿足要求；另一類是對(duì)數(shù)放大，其輸出信號(hào)和輸入信號(hào)之間成對(duì)數(shù)關(guān)系，一般在檢測(cè)細(xì)胞膜表面抗原時(shí)使用，由于細(xì)胞膜表面抗原的分布有時(shí)相差幾十倍，甚至上萬(wàn)倍，如用線性放大，無(wú)法在一張圖上清晰的將細(xì)胞陽(yáng)性群和陰性群同時(shí)顯示出來(lái)，因此通常選用對(duì)數(shù)放大測(cè)量。

如何進(jìn)行電壓調(diào)節(jié)？

首先我們需要調(diào)節(jié)的是細(xì)胞物理圖顯示的電壓，即FSC和SSC的電壓，這個(gè)可以用空白管細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，需要注意的是如果細(xì)胞進(jìn)行了固定破膜處理，那么空白管也必須是固定破膜處理的細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)胞進(jìn)過(guò)固定破膜處理后會(huì)縮水變小，和未處理細(xì)胞物理分布圖不一樣，一般情況下通過(guò)調(diào)節(jié)FSC和SSC電壓，使細(xì)胞群體分布在坐標(biāo)軸的中央部位，如果檢測(cè)的目標(biāo)細(xì)胞體積較小，可以適當(dāng)提高電壓值，使目標(biāo)細(xì)胞與細(xì)胞碎片在流式圖中能夠完全分離；如果檢測(cè)的目標(biāo)細(xì)胞體積較大，可以適當(dāng)降低電壓值，使所有的目標(biāo)細(xì)胞群完整顯示于流式圖中，防止細(xì)胞群接近于流式圖的邊界而變形扭曲或者完全處于邊界外。

其次我們需要調(diào)節(jié)每個(gè)熒光通道的電壓，熒光通道電壓調(diào)節(jié)最好用峰圖顯示，每個(gè)熒光的單染管都要進(jìn)行上機(jī)調(diào)節(jié)，一般我們以陽(yáng)性群細(xì)胞的峰值與儀器顯示的最高對(duì)數(shù)值少一個(gè)數(shù)量級(jí)（例如儀器最高可以顯示106，那么陽(yáng)性群峰值在105左右）為準(zhǔn)。陰性細(xì)胞群從0顯示起峰，當(dāng)然有時(shí)候需要考慮到熒光補(bǔ)償?shù)挠绊懀覀儠?huì)通過(guò)降低熒光通道的電壓，來(lái)減少熒光的溢漏，這種情況會(huì)導(dǎo)致陰性細(xì)胞群體壓邊（部分陰性細(xì)胞在圖上不顯示）。

最后我們需要將熒光補(bǔ)償干擾的兩兩通道用散點(diǎn)圖顯示出來(lái)，在上機(jī)分析對(duì)應(yīng)的單染管進(jìn)行補(bǔ)償調(diào)節(jié)，將所有通道補(bǔ)償參數(shù)確定后，電壓才能確認(rèn)，如果有的補(bǔ)償參數(shù)調(diào)節(jié)不好，需要通過(guò)平衡電壓來(lái)優(yōu)化（以下詳述），優(yōu)化電壓后再來(lái)確定補(bǔ)償。

電壓和補(bǔ)償?shù)年P(guān)聯(lián)性？

調(diào)節(jié)補(bǔ)償時(shí)，一定要先調(diào)節(jié)好電壓參數(shù)，才能調(diào)節(jié)補(bǔ)償，補(bǔ)償調(diào)節(jié)完成后，電壓參數(shù)不能改變。由于在不同的電壓條件下，熒光染料的激發(fā)效能也會(huì)不同，因此出現(xiàn)補(bǔ)償調(diào)節(jié)異常時(shí)，需要降低每個(gè)PMT的電壓，因?yàn)檩^大的電壓會(huì)造成過(guò)多的熒光溢漏（圖1）；

圖1：通過(guò)降低電壓來(lái)優(yōu)化補(bǔ)償

此外如果兩個(gè)熒光補(bǔ)償通道之間的電壓差過(guò)大，也可能導(dǎo)致補(bǔ)償異常，這個(gè)時(shí)候需要平衡兩個(gè)通道之間的電壓來(lái)減少補(bǔ)償（圖2）。

電壓沒(méi)調(diào)節(jié)好就上樣收集數(shù)據(jù)了，如何補(bǔ)救？
如果FSC和SSC電壓沒(méi)調(diào)節(jié)好，是細(xì)胞無(wú)法分群，或者細(xì)胞壓邊沒(méi)有顯示，在 用flowjo軟件分析數(shù)據(jù)時(shí)可以進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，例如以下情況，F(xiàn)SC和SSC電壓過(guò)小，細(xì)胞無(wú)法分群，這個(gè)時(shí)候可以點(diǎn)擊做標(biāo)注的T按鈕，選擇customize Axis，通過(guò)降低坐標(biāo)軸閾值(點(diǎn)擊減號(hào))使細(xì)胞群體放大，橫縱坐標(biāo)都調(diào)節(jié)好后可以圈門分析細(xì)胞，反之亦然。

圖3：FSC和SSC閾值調(diào)整過(guò)程

如果熒光通道的電壓沒(méi)有調(diào)節(jié)好，熒光圖上顯示的細(xì)胞可能壓邊，這個(gè)時(shí)候也可以通過(guò)上述方法進(jìn)行調(diào)節(jié)。如圖4，熒光信號(hào)壓邊，沒(méi)有全部顯示，這個(gè)時(shí)候我們可以點(diǎn)擊熒光通道上的T按鈕，選擇customize Axis，通過(guò)放大坐標(biāo)軸閾值(點(diǎn)擊加號(hào))使細(xì)胞群體都顯示在坐標(biāo)軸，橫縱坐標(biāo)都調(diào)節(jié)好后可以進(jìn)行正常圈門分析細(xì)胞。

圖4：熒光信號(hào)閾值調(diào)整過(guò)程

由于以上補(bǔ)救方法在部分儀器收集的數(shù)據(jù)上不能使用，因此該方法僅供大家參考使用，最好還是正確調(diào)節(jié)好電壓，使我們的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。